Domanda

In quale tampone devono essere preparate le cellule prima del sorting?

Risposta

• In linea generale, qualsiasi tampone fisiologico può essere usato, ma è essenziale evitare i clumps (aggregati cellulari).
• Per cellule procariotiche: PBS (phosphate buffered saline).
• Per cellule eucariotiche: PBS o HBSS senza Ca²⁺/Mg²⁺ e con ≤2% FBS o BSA.

I terreni standard per colture eucariotiche contengono Ca²⁺, Mg²⁺ e proteine sieriche che favoriscono l’aggregazione.
Molte cellule beneficiano della presenza di proteine nel tampone (es. 2% FBS o BSA), ma concentrazioni >5% possono causare aggregati e ostruzioni.

• Per linee cellulari e cellule aderenti, è raccomandata l’aggiunta di 0,5 mM EDTA, aumentabile a 5 mM per cellule molto adesive.
• In sospensioni con alta percentuale di cellule morte, il DNA libero può ricoprire le cellule e causare gravi aggregazioni: aggiungere DNAse II (20–100 μg/mL; 10 U/mL) può aiutare.
• Per cellule sensibili al pH, è consigliabile aggiungere HEPES (10–25 mM), per tamponare le variazioni di pH dovute all’alta pressione.
• L’aggiunta di antibiotici è consigliata per sorting in condizioni asettiche.