Citofluorimetria

• Quando è richiesta un’elevata purezza (superiore al 95%) della popolazione cellulare target.
• Per separazioni basate su colorazioni monocromatiche o policromatiche con coloranti fluorescenti o anticorpi marcati con fluorofori.
• Per separazioni basate su colorazioni intracellulari, ad esempio del DNA o di antigeni interni.
• Per la separazione di popolazioni che presentano una bassa densità di recettori di superficie, a cui possono legarsi anticorpi coniugati a fluorofori.
• Per l’arricchimento di popolazioni cellulari sulla base della densità dei recettori di superficie.

Il BD FACSAria III è un sorter dotato di noozles da 70, 85, 100 e 130 μm. Generalmente, il diametro delle cellule da ordinare dovrebbe essere almeno 5 volte più piccolo rispetto alla dimensione dell’ugello. Su FACSAria III è inoltre avere a disposizione 3 neutral density ( 1.0-1.5.2) per poter definire meglio il forward scatter in base alle caratteristiche morfologiche delle cellule da separare.

Per rispondere a questa domanda, sono necessarie le seguenti informazioni:

1. Qual è la percentuale della popolazione cellulare da separare?
2. Quante cellule ti servono dopo il sorting?
3. Cosa è più importante: alta purezza o resa totale?
4. Quanto sono fragili o grandi le cellule?

La durata della procedura di sorting dipende da tutti questi parametri.
Ecco un esempio:
Quante cellule devo preparare per ottenere 1×10⁶ cellule di una popolazione che rappresenta il 10% del campione?
1×10⁶ = 0,1 [10% della popolazione target] × 10×10⁶ cellule iniziali.
Tuttavia, la resa reale si aggira intorno all’80–90% di questo valore teorico.
Quindi, il numero iniziale di cellule dovrebbe essere:
10×10⁶ × 100 / [80–90] = 11–12,5×10⁶ cellule.
La resa può essere significativamente inferiore se le cellule sono di scarsa qualità (scarsa vitalità, aggregazione, ecc.) o se si richiede alta purezza.
Bisogna inoltre ricordare che anche che una parte delle cellule verrà consumata per impostare il sorter.
Se è la prima volta che si separa un campione, potrebbe essere necessario avere  più cellule rispetto agli esperimenti successivi.

Le percentuali effettive di recupero dipendono da numerosi fattori:

• Qualità delle cellule: è il fattore che influisce maggiormente sulla resa. Le cellule devono essere senza aggregati ed in sospensione singola.
• Morte cellulare prima e dopo il sorting, o perdita per adesione alle pareti delle provette.
• Velocità di sorting: maggiore è la velocità, minore è la resa.
• Precisione dell’impostazione del sorter.
• Se si tratta di un sorting per arricchimento (enrichment) o per purezza: i sorting per arricchimento hanno rese più alte.
• Perdite durante la preparazione del campione.

Quando un utente supporne di aver portato un campione da 1×10⁷ cellule, questo numero dovrebbe essere il risultato di conteggi effettuati dopo tutta la preparazione, inclusa la filtrazione per rimuovere aggregati.
I sorter contano accuratamente le cellule che passano nello strumento.
Quindi, se si suppone di aver portato 1×10⁷ cellule ma il sorter ne rileva solo 0,6×10⁷, vuol dire che le cellule effettive non sono 1×10⁷.
Va sottolineato inoltre che una piccola aliquota delle cellule sortate potrà essere usata per valutare l’efficienza del sorting, ma In casi di resa molto bassa, questa verifica può essere omessa.
Tuttavia, questa analisi post-sort è essenziale se si prevede di pubblicare i risultati dell’esperimento.
Consiglio: usare almeno il 50% di cellule in più rispetto al valore teorico necessario per il sorting.

In generale, si può prevedere il recupero di almeno il 50% del numero teorico di cellule. Nella maggior parte dei casi, l’efficienza del sorting supera questa percentuale. Le perdite sono causate dai fattori già discussi nella FAQ 4.

• Utilizzare provette in polipropilene per la preparazione e il sorting delle cellule.
• Utilizzare provette di raccolta in polipropilene e riempirle (circa 1/2 mL) con terreno contenente 30% di siero (per cellule eucariotiche).
• Contare le cellule immediatamente prima del sorting (dopo tutti i lavaggi).
• Usare la modalità di sorting “Yield” per migliorare la resa (NB: la purezza diminuirà!).
• Processare subito le provette di raccolta dopo il riempimento o la fine del sorting.

La velocità massima di acquisizione dello strumento è di circa 25.000 eventi al secondo.
Per alcune preparazioni cellulari, velocità più basse, come 5.000 eventi al secondo o meno, possono essere consigliabili per ottenere una maggiore purezza.

È necessaria circa 1 ora ogni giorno lavorativo per permettere all’operatore di preparare lo strumento, stabilizzare il flusso e completare i controlli qualità (QC).
A questo seguono 15–45 minuti per impostare la strategia di sorting, e circa 15 minuti per l’analisi post-sort.
La durata del sorting dipende principalmente da quante cellule devono essere analizzate e separate.
Teoricamente, con il BD FACSAria III si possono processare fino a 20-30 milioni di eventi/ora.
Altri fattori che influenzano la durata della procedura includono:

• La qualità delle cellule.
• La percentuale della popolazione da ordinare.
• Il numero di cellule richiesto dopo il sorting.
• Se è più importante la resa totale o la purezza.
• La concentrazione cellulare.

Più le cellule sono diluite, più tempo è necessario.
Per campioni diluiti, anche il volume influisce: solitamente, 1 mL di campione (fino a 20-30 milioni di cellule) può essere processato in circa 2 ore.

È importante sottolineare che la tossicità delle colorazioni pre-sort può influenzare la vitalità cellulare e andrebbe valutata prima dell’esperimento di sorting.
In generale, le cellule possono subire stress meccanico durante il processo, ma questo può essere minimizzato mantenendo le cellule sempre alla temperatura, pH e nel terreno più adatto.
Il BD FACSAria III è dotato di un noozle da 100 μm, che può essere utilizzato a pressione inferiore rispetto agli ugelli più piccoli, riducendo automaticamente lo stress meccanico.
Inoltre, l’utente può impostare la temperatura della camera, contribuendo a mantenere le condizioni ottimali per le cellule.

I campioni dovrebbero essere mantenuti in un terreno ricco, il più adatto possibile alle cellule.
Per le cellule eucariotiche, è consigliabile aggiungere proteine sieriche, ma senza superare una concentrazione del 2–3%, poiché un alto contenuto sierico nel campione può compromettere la precisione del sorting.
Per le linee cellulari eucariotiche e le cellule aderenti, è raccomandata l’aggiunta di 0,5 mM di EDTA. Per cellule particolarmente adesive, la concentrazione può essere aumentata fino a 5 mM.
Per sorting in condizioni sterili, è consigliata l’aggiunta di antibiotici. Inoltre, può essere utile aggiungere 25 mM di HEPES a pH 7,0.
Le provette di raccolta dovrebbero contenere una concentrazione sierica elevata (30%), poiché questa verrà diluita dal fluido del flusso (sheath fluid) proveniente dalle gocce di sorting.
Processare le cellule subito dopo il sorting aiuta a mantenere la vitalità cellulare.

La purezza massima ottenibile è compresa tra 99% e 100%.
Una purezza del 95%–100% può essere attesa per popolazioni ben separate dalle cellule indesiderate.
La purezza dipende dalla stabilità del sorter e da come vengono impostati i gates di sorting.
Per regioni non ben definite o sorting di tipo “enrichment”, la purezza può essere inferiore al 90%.

Mediante re-analisi della popolazione ordinata sullo stesso sorter dopo lavaggio oppure su un altro citofluorimetro.
In quest’ultimo caso, assicurarsi che la sensibilità degli strumenti sia comparabile.

• Se si hanno troppo poche cellule, il sorting sarà più lungo e la vitalità potrà risentirne.
• Se le cellule sono troppo concentrate, si rischia una diminuzione della purezza e ostruzione dello strumento.

👉 Una preparazione cellulare ottimale migliora la vitalità e porta a una resa più alta.

Linee guida:

• Se si hanno meno di 10×10⁶ cellule, preparare le cellule in un volume di 0,5 mL.
• La concentrazione raccomandata per BD FACSAria III è di 20-30 milioni/mL, a seconda del tipo cellulare.
• Se troppo concentrate, possiamo diluirle in facility
• Se non si è certi, è meglio portarle più concentrate (possono sempre essere diluite).
• Contare le cellule subito prima del sorting (dopo tutti i lavaggi).

• In linea generale, qualsiasi tampone fisiologico può essere usato, ma è essenziale evitare i clumps (aggregati cellulari).
• Per cellule procariotiche: PBS (phosphate buffered saline).
• Per cellule eucariotiche: PBS o HBSS senza Ca²⁺/Mg²⁺ e con ≤2% FBS o BSA. I terreni standard per colture eucariotiche contengono Ca²⁺, Mg²⁺ e proteine sieriche che favoriscono l’aggregazione. Molte cellule beneficiano della presenza di proteine nel tampone (es. 2% FBS o BSA), ma concentrazioni >5% possono causare aggregati e ostruzioni.
• Per linee cellulari e cellule aderenti, è raccomandata l’aggiunta di 0,5 mM EDTA, aumentabile a 5 mM per cellule molto adesive.
• In sospensioni con alta percentuale di cellule morte, il DNA libero può ricoprire le cellule e causare gravi aggregazioni: aggiungere DNAse II (20–100 μg/mL; 10 U/mL) può aiutare.
• Per cellule sensibili al pH, è consigliabile aggiungere HEPES (10–25 mM), per tamponare le variazioni di pH dovute all’alta pressione.
• L’aggiunta di antibiotici è consigliata per sorting in condizioni asettiche.

• Il volume minimo raccomandato è 0,4–0,5 mL.
• Il volume massimo che può essere processato in un singolo run è 3-4 mL.

Le cellule devono essere prive di aggregati (clump) e costituire una sospensione a singola cellula.
Pertanto, ad esempio, le cellule (eucariotiche) di grandi dimensioni devono essere filtrate, idealmente immediatamente prima del sorting, utilizzando filtri cellulari (cell strainers) da 20–50 µm.

Sono richieste provette sterili da 5 mL per FACS:
Tubi in polipropilene a fondo arrotondato da 5 mL, 12×75 mm, sterili, con tappo.
Altre provette di raccolta possono essere preparate, se necessario.

Si consiglia di trasportare le cellule in ghiaccio o a temperatura ambiente (in base al tipo cellulare), protette dalla luce.

Sul BD FACSAria III è possibile separare fino a quattro popolazioni cellulari contemporaneamente (4-way sorting), utilizzando provette FACS da 5 mL (in polipropilene, a fondo arrotondato, 12×75 mm, sterili), provette Falcon coniche da 15 mL, oppure provette Eppendorf da 1,5 mL.
Si prega di portare provette di raccolta etichettate, contenenti circa 1/2 mL di terreno di coltura cellulare.
Le provette FACS sterili da 5 mL in polipropilene sono necessarie anche per i controlli post-sort di acquisizione.
Il BD FACSAria III è inoltre dotato di un supporto per la raccolta di singole cellule in piastre da 96 (e 384) pozzetti. Le piastre vanno portate già riempite di terreno.

È necessario verificare in anticipo se le proteine fluorescenti o i fluorocromi utilizzati possono essere effettivamente rilevate dal citofluorimetro.
Non tutti i fluorocromi osservabili al microscopio possono essere misurati anche al citofluorimetro.
Per verificare che la configurazione ottica sia adatta, sono disponibili online degli strumenti chiamati Spectrum Viewers, offerti da varie aziende, ad esempio:

• https://www.bdbiosciences.com/us/s/spectrumviewer
• https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectra-viewer.html

La configurazione del BD FACSAria III è riportata nella sezione “Strumenti”.

Sì. Il citofluorimetro BD FACSAria III supporta il sorting su piastra (plate sorting). Tuttavia, la configurazione del sorting è diversa da quella per bulk sorting, richiede tempo aggiuntivo e preavviso.

L’index sorting è una funzionalità avanzata della citometria a flusso che consente di registrare informazioni dettagliate su ogni singola cellula separata. Questa funzione fornisce i dati fenotipici di ogni cellula raccolta in una piastra da 96 pozzetti. Le informazioni includono lo scatter della luce e i valori di intensità di fluorescenza mediana (MFI) per ciascun canale fluorescente. L’index sorting permette quindi di tracciare ogni cellula separata e collegare il suo fenotipo al profilo di espressione genica, se analizzato dopo il sorting. Per analizzare l’index sorting, è possibile analizzare i file .fcs con il software FlowJo disponibile in facility presso workstation dedicata.

Il numero massimo di parametri utilizzabili contemporaneamente è 18: forward scatter, side scatter e 16 parametri fluorescenti.
I laser UV e violetto non possono essere utilizzati contemporaneamente nello stesso esperimento.

Si raccomanda di portare i seguenti controlli per esperimenti di citometria a flusso:

1. Cellule non colorate come controllo negativo.
2. Cellule non stimolate/non trattate come controllo biologico.
3. Cellule o beads marcati singolarmente per la compensazione.
4. Controllo isotipo o FMO (fluorescence minus one).
5. Se si utilizza un colorante per escludere cellule morte, è necessario portare un controllo di vitalità separato per un corretto gating, poiché le cellule morte non sempre possono essere escluse in base alla dispersione della luce. Si consiglia di uccidere una parte delle cellule, mescolarle con cellule vive e poi colorarle con il proprio colorante di vitalità (es. PI, 7-AAD, DAPI, TO-PRO-3).
6. Un controllo non trasfettato in caso di sorting di proteine fluorescenti.

Le cellule morte rappresentano un problema rilevante nella separazione cellulare.
In generale, se in una sospensione ci sono più del 10% di cellule morte, è necessario rimuoverle. Al di sotto di questa soglia, il sorting potrebbe risentirne negativamente.

I motivi principali per eliminare le cellule morte sono:

• Le cellule morte rilasciano DNA libero che può aggregare le cellule.
• Possono legarsi in modo aspecifico agli anticorpi, portando a falsi positivi.

Il primo problema può essere ridotto con l’aggiunta di DNasi I.
Nel secondo caso, il problema si aggrava soprattutto nelle separazioni mediate da anticorpi, perché le cellule morte non target possono comunque legarsi agli anticorpi, compromettendo la purezza.

La soluzione più efficace è rimuovere completamente le cellule morte o morenti con un passaggio di pre-separazione.

Il sorter BD FACSAria III non è collocato in una cappa a flusso laminare di classe II, quindi nessun sorting può essere considerato “sterile” in senso assoluto.
Tuttavia, il sorting viene eseguito in modalità asettica:

• Il liquido sheath passa attraverso un filtro da 0,22 µm.
• Il sorter viene regolarmente decontaminato (il giorno prima e dopo ogni sessione) con FACSClean™ e sterilizzato con etanolo al 70%.

È responsabilità dell’utente preparare i campioni in condizioni sterili (consigliato conservare un’aliquota di controllo pre-sort per verificarne la sterilità). Tutti i materiali (buffer, terreni, anticorpi, provette, puntali) devono essere sterili.
Per le cellule eucariotiche sortate, si raccomanda l’uso di antibiotici nel terreno.
Il nostro centro è comunque dotato di una cappa a flusso laminare biologica di classe II per filtrare i campioni.

Prima di procedere con il sorting, le cellule devono essere caratterizzate (tramite citofluorimetria o microscopio a fluorescenza).
Si prega di portare con sé una stampa recente dei dati alla prima visita per l’incontro con il personale.
Si raccomanda la puntualità!

È responsabilità dell’utente effettuare il salvataggio dei dati su un supporto secondario non appartenente al servizio FACS al momento della raccolta e/o analisi.

Per promuovere il servizio FACS, si prega di citare il nostro Centro, Centro Grandi Strumenti, in tutte le pubblicazioni e domande di finanziamento in cui sono stati utilizzati gli strumenti della core facility o l’expertise del nostro staff ha contribuito alla realizzazione del lavoro.
Vi invitiamo a inviarci un PDF degli articoli accettati che contengano dati generati dal nostro servizio e a comunicarci se i vostri progetti finanziati includono dati ottenuti tramite il FACS-service.
Per maggiori informazioni, si prega di consultare la policy.