Microscopia Ottica
“A picture is worth a thousand words”, così Stefan Hell, Nobel per la Chimica e padre della nanoscopia, apre la lecture tenuta l’8 Dicembre 2014 a Stoccolma. E per le Scienze della Vita è certamente vero fin dall'invenzione del microscopio.
Descrizione
Il Laboratorio di Microscopia ottica offre supporto e assistenza ai propri utenti a partire dalla progettazione dell’esperimento, attraverso l’acquisizione delle immagini sino all’analisi quantitativa del dato.
L’ampia gamma di strumentazione all’avanguardia, accessibile in parte anche in autonomia previo training, e di tecniche avanzate disponibili permette di rispondere ai più diversi quesiti scientifici.
Il laboratorio è equipaggiato con microscopi widefield e sistemi di sezionamento ottico e di nanoscopia, per acquisizioni su campioni fissati e vitali.
Sono inoltre disponibili una stanza per la preparativa del campione (BSL2) e una workstation dedicata all’analisi d’immagine.
Strumentazione
Software
| Nome | Descrizione | |
|---|---|---|
| Zeiss arivis Pro Software | Zeiss arivis Pro è una soluzione software completa per la visualizzazione, la condivisione, l’analisi e la presentazione di dati di immagini multicanale e multidimensionale (2D, 3D e 4D). Il software supporta e gestisce oltre 30 formati di file commerciali, elaborando in modo efficiente file anche di grandi dimensioni. Arivis Pro consente l’analisi di modelli anche complessi tramite pipeline standard o basate su modelli di AI e consente l’integrazione dei flussi di lavoro tramite scripting Python. | link |
| SVI Huygens Deconvolution Software | Huygens è un software creato su misura per la deconvoluzione e l’elaborazione delle immagini di microscopia in grado di deconvolvere un’ampia gamma di immagini (widefield, confocale, light-sheet, STED). La sua interfaccia-utente guida l’utilizzatore attraverso il processo di deconvoluzione delle immagini, consentendo il confronto tra i risultati grezzi e quelli deconvoluti ed il rendering multidimensionale dei dati. | link |
| Open source Image Processing Software | CellProfiler, ImageJ/Fiji, Leica LasX Lite. |
Tariffe
Il regolamento del Centro prevede l’applicazione di un tariffario per l’utilizzo delle strumentazioni:
INTERNI
La consultazione è riservata al personale dell’Ateneo: vai alla pagina riservata
ESTERNI
| Strumento/Servizio | Uso autonomo* (tariffa oraria) | Con supporto del tecnico (tariffa oraria) |
|---|---|---|
| Microscopi STED/DSL/TIRF/TCS SP8 | non previsto | € 150,00 |
| Microscopio SPINNING DISK | non previsto | € 150,00 |
| Microscopio DM6 | €25,00 | € 50,00 |
| Analisi dati | non previsto | € 100,00 |
| Trattamenti particolari del campione, organizzazione e trattamento dei dati, redazione di rapporti | non previsto | € 100,00 |
* uso autonomo consentito previa comprovata competenza nell’uso della strumentazione
ESTERNI CONVENZIONATI
| Strumento/Servizio | Uso autonomo* (tariffa oraria) | Con supporto del tecnico (tariffa oraria) |
|---|---|---|
| Microscopi STED/DSL/TIRF/TCS SP8 | non previsto | € 60,00 |
| Microscopio SPINNING DISK | non previsto | € 36,00 |
| Microscopio DM6 | non previsto | € 9,60 |
| Analisi dati | non previsto | € 30,00 |
| Trattamenti particolari del campione, organizzazione e trattamento dei dati, redazione di rapporti | non previsto | € 30,00 |
* uso autonomo consentito previa comprovata competenza nell’uso della strumentazione
Pubblicazioni
FAQ e Protocolli
FAQ
Che tipi di supporti possono essere utilizzati per esperimenti sui nostri strumenti?
I nostri microscopi sono dotati di diversi adattatori, sia commerciali che prodotti dal Laboratorio di Prototipazione del CGS, che permettono di visualizzare i campioni su molteplici tipi di supporti: piastre di Petri da 35mm, piastre multi-pozzetto, slide multi-pozzetto ed altre soluzioni.
Rivolgersi ai responsabili degli strumenti per verificare la compatibilità dei propri supporti prima di procedere all’esperimento.
Rivolgersi ai responsabili degli strumenti per verificare la compatibilità dei propri supporti prima di procedere all’esperimento.
Perché i vetrini vanno montati e quale soluzione di montaggio è indicata per i miei vetrini?
La soluzione di montaggio ha il compito di mantenere il campione in posizione durante l’imaging, di preservare a lungo il campione, di ridurre l’entità delle aberrazioni ottiche andando a uniformare l’indice di rifrazione dell’ambiente circostante al campione con quello dell’obbiettivo utilizzato e, contenendo composti anti-fade, di ridurre il rate di photobleaching dei fluorofori utilizzati.
La scelta del mezzo di montaggio dipende in gran parte dal tipo di campione in esame ed esistono numerose soluzioni di montaggio generalmente a base di solventi organici come toluene o xilene o a base acquosa, sia acquistabili ready-to-use sia preparabili in laboratorio. I solventi a base acquosa sono i più utilizzati per la preparazione dei campioni in microscopia ottica e si suddividono in due classi, a seconda che solidifichino o meno. I montanti polimerizzanti hanno il vantaggio di poter essere conservati, anche a -20°C, per lunghi periodi e di preservare a lungo gli staining presenti. Purtroppo, la loro solidificazione porta, nell’arco di qualche giorno, ad uno schiacciamento del campione e quindi non sono la scelta migliore qualora lo scopo dell’imaging sia la ricostruzione 3D della struttura del campione o si vogliano effettuare analisi di colocalizzazione di proteine. In questo caso i campioni dovrebbero essere montati utilizzando una soluzione che rimanga liquida, come quelle a base di glicerolo. In questo caso la struttura 3D non viene intaccata, ma gli staining si preservano per periodi decisamente inferiori, qualche giorno, ed il bordo dei vetrini deve essere fissato sul porta-oggetto mediante l’uso di VALAP o smalto.
La scelta del mezzo di montaggio dipende in gran parte dal tipo di campione in esame ed esistono numerose soluzioni di montaggio generalmente a base di solventi organici come toluene o xilene o a base acquosa, sia acquistabili ready-to-use sia preparabili in laboratorio. I solventi a base acquosa sono i più utilizzati per la preparazione dei campioni in microscopia ottica e si suddividono in due classi, a seconda che solidifichino o meno. I montanti polimerizzanti hanno il vantaggio di poter essere conservati, anche a -20°C, per lunghi periodi e di preservare a lungo gli staining presenti. Purtroppo, la loro solidificazione porta, nell’arco di qualche giorno, ad uno schiacciamento del campione e quindi non sono la scelta migliore qualora lo scopo dell’imaging sia la ricostruzione 3D della struttura del campione o si vogliano effettuare analisi di colocalizzazione di proteine. In questo caso i campioni dovrebbero essere montati utilizzando una soluzione che rimanga liquida, come quelle a base di glicerolo. In questo caso la struttura 3D non viene intaccata, ma gli staining si preservano per periodi decisamente inferiori, qualche giorno, ed il bordo dei vetrini deve essere fissato sul porta-oggetto mediante l’uso di VALAP o smalto.
Nel Laboratorio di Microscopia Ottica è possibile effettuare analisi su campioni vitali ed esperimenti di live cell imaging nel tempo?
La maggior parte dei nostri microscopi è dotato di incubatori in grado di gestire la corretta temperatura e concentrazione di CO2. È quindi possibile analizzare la dinamica dei processi biologici nel tempo, sia con esperimenti in luce trasmessa (Brightfield, Differential Interference Contrast, Phase Contrast) che in fluorescenza.
Nel Laboratorio di Microscopia Ottica è possibile effettuare esperimenti di Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP)?
Gli esperimenti di foto-perturbazione sono ampiamente utilizzati per studiare i processi dinamici e la diffusione di strutture subcellulari o proteine di interesse. Il photobleaching irreversibile del fluoroforo in un’area specifica del campione e la successiva analisi dell’eventuale recupero della fluorescenza nella medesima area sono utilizzate per estrapolare informazioni riguardo la dinamica e la conformazione dell’ambiente cellulare sotto esame. I nostri sistemi confocali sono dotati di sorgenti laser di potenza adeguata per realizzare esperimenti di foto-perturbazione, il personale ha esperienza nella realizzazione di questo tipo di esperimenti ed inoltre è possibile usufruire del servizio di analisi di immagine per ottenere i parametri descrittivi la dinamica del processo in esame.
Dove posso trovare informazioni relative agli spettri di eccitazione ed emissione dei fluorofori?
Esistono moltissimi siti che raccolgono le informazioni relative ai fluorofori utilizzati nella microscopia in fluorescenza. Ad esempio, per ciò che concerne le proteine naturalmente fluorescenti, potreste trovare utile la consultazione di questo sito: https://www.fpbase.org/
