Citofluorimetria
"Cytometry reflects the beauty of the world one cell at a time." - Dorothy E. Lewis
Descrizione
Il Laboratorio di Citofuorimetria offre supporto e assistenza ad utenti interni ed esterni a più livelli.
LIVELLO 1 – Formazione e Training
Competenze tecniche e analitiche
- Training pratico su strumentazione: citofluorimetro (BD), citofluorimetro ad immagini (Amnis), sorter (BD)
- Training software per analisi (FACSDiva, FacsSuite, IDEAS software (Amnis), FlowJo)
- Corsi teorici di base e avanzati
LIVELLO 2 – Assistenza scientifica
Supporto esperto per esperimenti complessi
- Assistenza per pannelli multiparametrici (fenotipizzazione)
- Assistenza per pannelli multiparametrici (sorting: purity, yield, single cell)
LIVELLO 3 – Accessibilità e collaborazione
Apertura a utenti interni ed esterni
- Supporto tecnico e scientifico personalizzato
- Collaborazioni su progetti complessi
Il laboratorio è equipaggiato con 3 strumenti di citometria a flusso ed inoltre è disponibile una stanza per la preparativa del campione (BSL2) e una workstation dedicata all’analisi d’immagine.
Strumentazione
Software
| Nome | Descrizione | |
|---|---|---|
| FACSSuite | Il software che controlla il citofluorimetro BD FACSLyric™ è composto da due applicazioni: BD FACSuite™ Clinical Application e BD FACSuite™ Application. Entrambe offrono un’interfaccia facile da usare per l’acquisizione e l’analisi dei dati con il sistema BD FACSLyric™. La BD FACSuite™ Clinical Application supporta i test diagnostici IVD, mentre la BD FACSuite™ Application, invece, è progettata per test personalizzati definiti dall’utente grazie ad una configurazione semplice, riproducibile e trasferibile, facilitando la standardizzazione. | link |
| FACSDiva | Il software BD FACSDiva™ rappresenta un sistema completo di strumenti per la configurazione del citofluorimetro e delle applicazioni, l’acquisizione dei dati e l’analisi dei risultati- E’ stato progettato per semplificare i flussi di lavoro in citofluorimetria nei laboratori moderni e ad alta attività. Il software BD FACSDiva™ offre funzionalità che aiutano gli utenti a integrare i sistemi citofluorimetrici in diverse applicazioni, come il sorting con index sorting ed applicazioni a singola cellula. Fornisce strumenti pratici e intuitivi per la creazione dei layout sperimentali, semplificando l’impostazione degli esperimenti. Consente una visualizzazione grafica dell’intero esperimento e permette l’aggiunta rapida di etichette, parole chiave e attributi di acquisizione a un singolo tubo, a più tubi, a campioni o all’intero esperimento. Offre la possibilità di salvare template di esperimenti, analisi e pannelli per un riutilizzo futuro, senza compromettere l’integrità dei dati. Consente di salvare impostazioni specifiche per identificare correttamente le popolazioni cellulari di interesse tramite la funzione “application settings”. Una volta eseguito il controllo prestazionale giornaliero per aggiornare le impostazioni, è possibile applicare queste impostazioni per garantire che le relative applicazioni vengano eseguite in modo coerente giorno dopo giorno. | link |
| FlowJo | il software più utilizzato per l’analisi citofluorimetrica. È disponibile in facility su una workstation dedicata. Caratteristiche: Analisi avanzata dei dati: consente di analizzare grandi volumi di dati, anche con decine di parametri per cellula; Gating dinamico: permette di definire e raffinare popolazioni cellulari in modo visivo, interattivo e preciso; Statistica e grafici: calcola statistiche su ogni popolazione (media, deviazione standard, percentuali, ecc.) e genera grafici come istogrammi, dot plot e density plot; Plugin: include moduli per analisi avanzate come cinetiche, ciclo cellulare, apoptosi, clusterizzazione automatica, t-SNE, UMAP e SPADE, index sorting; Compatibilità: può aprire file .fcs, i file standard per i dati di citofluorimetria, ed è compatibile con dati provenienti da strumenti di diversi produttori (BD, Beckman Coulter, Sony, Cytek, ecc.); Batch analysis: consente l’analisi automatizzata di decine o centinaia di campioni con lo stesso schema di gating. | link |
| Inspire | è un software di acquisizione dati sviluppato da Amnis/Luminex per l’uso con il citofluorimetro a flusso ImageStreamX Mark II. Questo strumento combina le funzionalità della citofluorimetria tradizionale con l’imaging ad alta risoluzione, consentendo l’acquisizione simultanea di immagini in campo chiaro e fluorescenza di cellule in flusso. Permette l’acquisizione ad alta velocità catturando immagini in campo chiaro e campo oscuro; gestisce l’acquisizione di immagini da una fotocamera CCD TDI, garantendo una risoluzione spaziale elevata (fino a 0,3 × 0,3 µm per pixel con obiettivo 60x). I dati acquisiti possono essere analizzati con il software IDEAS, che offre strumenti quantitativi per l’analisi delle immagini cellulari e delle statistiche di popolazione. Applicazioni biologiche: Utilizzato per studiare processi cellulari come traslocazione, co-localizzazione, ciclo cellulare, apoptosi, autofagia e internalizzazione di vescicole. | |
| IDEAS | è il programma di analisi dati sviluppato da Amnis/Luminex, progettato specificamente per l’elaborazione dei dati generati dai citofluorimetri ImageStream. Permette di analizzare acquisite da citofluorimetri ad imaging, integrando l’intensità di fluorescenza con informazioni morfologiche, quantificando eventi cellulari complessi come co-localizzazione, traslocazione nucleare, morfologia nucleare, apoptosi, fagocitosi, internalizzazione. Permette di creare maschere personalizzate per identificare sotto-regioni della cellula (come nucleo, citoplasma, membrana) su cui calcolare misure statistiche. |
Tariffe
Il regolamento del Centro prevede l’applicazione di un tariffario per l’utilizzo delle strumentazioni:
INTERNI
La consultazione è riservata al personale dell’Ateneo: vai alla pagina riservata
ESTERNI
| Strumento/Servizio | Uso autonomo * (tariffa oraria) | Con supporto del tecnico (tariffa oraria) |
|---|---|---|
| CITOFLUORIMETRO BD FACSLyric | € 30,00 | € 60,00 |
| CITOFLUORIMETRO AMNIS IMAGE STREAM MARK II | € 45,00 | € 90,00 |
| CELL SORTER BD FACSAria III | € 40,00 | € 80,00 |
| Trattamenti particolari del campione, organizzazione e trattamento dei dati, redazione di rapporti | non previsto | € 100,00 |
* uso autonomo consentito previa comprovata competenza nell’uso della strumentazione
ESTERNI CONVENZIONATI
| Strumento/Servizio | Uso autonomo * (tariffa oraria) | Con supporto del tecnico (tariffa oraria) |
|---|---|---|
| CITOFLUORIMETRO BD FACSLyric | € 13,20 | € 40,70 |
| CITOFLUORIMETRO AMNIS IMAGE STREAM MARK II | € 13,20 | € 40,70 |
| CELL SORTER BD FACSAria III | € 39,60 | € 67,10 |
| Trattamenti particolari del campione, organizzazione e trattamento dei dati, redazione di rapporti | non previsto | € 30,00 |
* uso autonomo consentito previa comprovata competenza nell’uso della strumentazione
Pubblicazioni
FAQ e Protocolli
FAQ
| # | Domanda | Risposta |
|---|---|---|
| 1 | Quando dovrei utilizzare il FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting) invece di altri metodi di separazione come la centrifugazione su gradiente di densità o la immunomagnetica? | Quando è richiesta un’elevata purezza (superiore al 95%) della… (continua) |
| 2 | Quanto possono essere grandi le cellule che si possono separare? | Il BD FACSAria III è un sorter dotato di noozles da 70, 85, 100 e 130 μm. Generalmente… (continua) |
| 3 | Di quante cellule ho bisogno per la procedura di sorting? | Per rispondere a questa domanda, sono necessarie le seguenti… (continua) |
| 4 | Da cosa dipende la resa di un sorting? | Le percentuali effettive di recupero dipendono da numerosi fattori… (continua) |
| 5 | Quale percentuale del numero teorico di cellule può essere recuperata nella realtà e da cosa dipende? | In generale, si può prevedere il recupero di almeno il 50% del numero…(continua) |
| 6 | Ci sono modi per migliorare il sorting? | Utilizzare provette in polipropilene per la preparazione e il sorting delle cellule… (continua) |
| 7 | Quante cellule al secondo possono essere separate con un sorter BD FACSAria III? | La velocità massima di acquisizione dello strumento è di circa 25.000 eventi al secondo… (continua) |
| 8 | Quanto dura la procedura di sorting? | È necessaria circa 1 ora ogni giorno lavorativo per permettere all’operatore di preparare lo strumento, stabilizzare… (continua) |
| 9 | Le mie cellule subiranno danni durante il processo di sorting? | È importante sottolineare che la tossicità delle colorazioni pre-sort può influenzare la vitalità cellulare… (continua) |
| 10 | Come posso garantire la vitalità cellulare durante il sorting e ci sono modi per migliorarla? | I campioni dovrebbero essere mantenuti in un terreno ricco, il più adatto… (continua) |
| 11 | Qual è la purezza massima di una popolazione che può essere ottenuta e da cosa dipende? | La purezza massima ottenibile è compresa tra 99% e… (continua) |
| 12 | Come viene determinata la purezza della popolazione separata? | Mediante re-analisi della popolazione ordinata sullo stesso sorter dopo lavaggio oppure… (continua) |
| 13 | A quanto devono essere concentrate le cellule per la procedura di sorting? | Se si hanno troppo poche cellule, il sorting sarà più lungo e la vitalità potrà risentirne… (continua) |
| 14 | In quale tampone devono essere preparate le cellule prima del sorting? | In linea generale, qualsiasi tampone fisiologico può essere usato, ma è essenziale evitare i clumps… (continua) |
| 15 | Quale è il volume di risospensione prima del sorting? | Il volume minimo raccomandato è 0,4–0,5 mL… (continua) |
| 16 | Cosa bisogna osservare nella preparazione delle cellule? | Le cellule devono essere prive di aggregati (clump) e costituire una sospensione a singola cellula… (continua) |
| 17 | Quali provette sono necessarie per il sorting delle cellule? | Sono richieste provette sterili da 5 mL per FACS… (continua) |
| 18 | Come devo trasportare le cellule? | Si consiglia di trasportare le cellule in ghiaccio o a temperatura ambiente (in base al tipo cellulare), protette… (continua) |
| 19 | Che tipo di provette vengono utilizzate per la raccolta delle cellule? | Sul BD FACSAria III è possibile separare fino a quattro popolazioni cellulari contemporaneamente… (continua) |
| 20 | Quali fluorocromi possono essere misurati? | È necessario verificare in anticipo se le proteine fluorescenti o i fluorocromi utilizzati possono essere effettivamente rilevate… (continua) |
| 21 | È possibile separare singole cellule in piastre? | Sì. Il citofluorimetro BD FACSAria III supporta il sorting su piastra (plate sorting). Tuttavia, la configurazione del sorting… (continua) |
| 22 | Che cos’è l’index sorting? | L’index sorting è una funzionalità avanzata della citometria a flusso che consente di registrare informazioni dettagliate su ogni singola… (continua) |
| 23 | Quanti parametri possono essere utilizzati contemporaneamente per la strategia di sorting sul BD FACSAria III? | Il numero massimo di parametri utilizzabili… (continua) |
| 24 | Quali controlli devo portare con me? | Si raccomanda di portare i seguenti controlli per esperimenti di citometria a flusso: Cellule non colorate come controllo… (continua) |
| 25 | Perché è importante rimuovere le cellule morte nel sorting di cellule eucariotiche? | Le cellule morte rappresentano un problema rilevante nella separazione cellulare… (continua) |
| 26 | Il sorting viene eseguito in condizioni sterili? | Il sorter BD FACSAria III non è collocato in una cappa a flusso laminare di classe II, quindi nessun sorting può essere… (continua) |
| 27 | Quali altre preparazioni sono richieste? | Prima di procedere con il sorting, le cellule devono essere caratterizzate (tramite citofluorimetria o microscopio a fluorescenza)… (continua) |
| 28 | Come viene gestita la conservazione dei dati nel servizio FACS? | È responsabilità dell’utente effettuare il salvataggio dei dati su un supporto secondario non appartenente… (continua) |
| 29 | Riconoscimenti? | Per promuovere il servizio FACS, si prega di citare il nostro Centro, Centro Grandi Strumenti, in tutte le pubblicazioni e domande di finanziamento… (continua) |
Protocolli
- Linee guida per il sorting: pianificazione di un esperimento (link)
