Citofluorimetria

Alberto Azzalin
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La citometria a flusso o citofluorimetria è una metodologia che permette la  caratterizzazione sia a livello qualitativo sia quantitativo di una sospensione cellulare o di particelle. La tecnologia attuale permette l’analisi contemporanea di molteplici parametri sia fisici (dimensione e complessità cellulare) sia biochimici/molecolari (a seconda dell’antigene cellulare scelto). Il principio si basa sull’impiego di una sorgente luminosa che emette a lunghezza d’onda variabile intercettando perpendicolarmente le singole cellule che fluiscono in un flusso costante e lineare: i raggi direttamente deviati dalla cellula (“scatter”) forniscono le informazioni fisiche, le  fluorescenze di emissione forniscono le informazioni legate al target cellulare che si è deciso di studiare (tipicamente marcato con un anticorpo specifico legato ad un fluoroforo). Si misurano due tipi di “scatter”: il “forward scatter” (FSC), che dà informazioni sulla dimensione cellulare, e il “side scatter” (SSC) che dà informazioni sulla granularità citosolica. Esistono due tipi di citometria a flusso: una di tipo “non-sorting” che raccoglie i dati di “scatter” ed emissio ni di fluorescenza, ed una di tipo “sorting” che sfrutta tali informazioni per poter separare singole sottopopolazioni cellulari con determinati parametri, partendo dalla popolazione eterogenea iniziale.La versatilità e la capacità risolutiva della citofluorimetria ne ha permesso la diffusione in diversi ambiti, dalla biologia alla medicina passando per la farmacologia. In ambito biologico, le applicazioni sono molteplici in base al marcatore cellulare che si misura (membrana, contenuto citosol, organelli, nucleo): analisi del ciclo cellulare, caratterizzazione delle cellule sangue, studio morte cellulare ed altro.

Strumentazione

Citofluorimetro BD FACS Lyric (Becton Dickinson) grazie  alla semplicità di utilizzo, la stabilità e l’automazione, permette analisi rapide e riproducibili. BD FACS Lyric è uno standard diagnostico per l’analisi delle cellule in ambito clinico ma è adatto anche all’attività di ricerca. Lo strumento presente in facility è dotato di 3 laser di eccitazione (405, 488 e 642 nm), acquisisce fino a 12 canali di fluorescenza, ad una velocità di acquisizione massima di 35.000 eventi al secondo senza limiti sul numero di eventi acquisiti. La sensibilità del BD FACS Lyric è 85 MESF per FITC e 20 MESF per PE. Il sistema è dotato di caricatore automatico a 30 o 40 tubi e il design della fluidica consente un’ampia selezione di dispositivi di input del campione. I dati possono essere analizzati in loco presso il centro sfruttando il software “BD FACS Suite” (v1.3) o esportati in FCS

Citofluorimetro ImageStreamX Mark II (Amnis/Luminex) grazie  alla semplicità di utilizzo, la stabilità e l’automazione, permette analisi rapide e riproducibili. BD FACS Lyric è uno standard diagnostico per l’analisi delle cellule in ambito clinico ma è adatto anche all’attività di ricerca. Lo strumento presente in facility è dotato di 3 laser di eccitazione (405, 488 e 642 nm), acquisisce fino a 12 canali di fluorescenza, ad una velocità di acquisizione massima di 35.000 eventi al secondo senza limiti sul numero di eventi acquisiti. La sensibilità del BD FACS Lyric è 85 MESF per FITC e 20 MESF per PE. Il sistema è dotato di caricatore automatico a 30 o 40 tubi e il design della fluidica consente un’ampia selezione di dispositivi di input del campione. I dati possono essere analizzati in loco presso il centro sfruttando il software “BD FACS Suite” (v1.3) o esportati in FCS. Il software “Inspire” (v.200.1) guida lo strumento nell’acquisizione delle immagini in campo chiaro e in fluorescenza delle cellule, mentre il software “IDEAS” (v.6.2) consente l’analisi quantitativa di immagini cellulari ed elaborare statistiche sulla popolazione. Lo strumento consente di analizzare diversi processi biologici come traslocazione, co-localizzazione, ciclo cellulare, apoptosi, autofagia, interiorizzazione delle vescicole e altre caratteristiche cellulari.

Citofluorimetro Sorter BD FACS Aria III (Becton Dickinson) si basa su tecnologie brevettate che consentono la separazione di cellule per una vasta gamma di applicazioni nella ricerca. La sensibilità del BD FACS Aria III è 85 MESF per FITC e 29 MESF per PE. La massima velocità di acquisizione del campione è di 70.000 eventi al secondo. Il sistema presente in facility è dotato di 5 laser: 355, 405, 488, 561, 633 nm che permette di misurare contemporaneamente un massimo di 18 colori.